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    實驗助手——質粒圖譜如何“瞅”

    點擊次數:4091 發布時間:2017-09-28

    每當拿到一個質粒圖譜,是不是一下就有點懵了?這些ori、RBS、tet是什么?這些箭頭代表什么,轉錄的方向嗎?不要著急,劍鈍生物把這些告訴你,也許會解決你的困惑。

    質粒和載體傻傻分不清楚
    質粒(Plasmid)是附加到細胞中的非細胞的染色體或核區DNA原有的能夠自主復制的較小的DNA分子(即細胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的質粒雖然都是環狀構型。

    載體即要把一個有用的基因(目的基因——研究或應用基因)通過基因工程手段送到生物細胞(受體細胞),需要運載工具(交通工具)攜帶外源基因進入受體細胞,這種運載工具就叫做載體(vector)。細菌或病毒質粒是重組DNA技術中常用的載體。

    簡而言之,質??梢哉f是一個統稱,載體是質粒改造過用來運載的工具

    選用質粒做載體的要求
    以常用的為例
    (1)選分子量小的質粒,即小載體(1-1.5kb)→不易損壞,在細菌里面拷貝數也多(也有大載體);
    (2)一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束,一般 10 個以上的拷貝,而嚴謹型質粒<10 個。
    (3)必需具備一個以上的酶切位點,有選擇的余地;
    (4)必需有易檢測的標記,多是抗生素的抗性基因,不特指多位 Ampr。
    無論選用哪種載體,先都要獲得載體分子,然后采用適當的限制酶將載體 DNA 進行切割,獲得分子,以便于與目的基因片段進行連接。

    如何一眼看穿質粒圖譜
    ①  復制起始位點Ori,了解質粒的類型(原核/真核/穿梭質粒),Ori的箭頭指復制方向,其他元件標注的箭頭多指轉錄方向(正向)。

    ②  再看篩選標記,如抗性,決定使用什么篩選標記:
    Ampr:水解β-內酰胺環,解除氨芐的毒性。
    tetr :可以阻止四環素進入細胞。
    camr:生成氯霉素羥乙?;苌?,使之失去毒性。
    neor(kanr):氨基糖苷磷酸轉移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。
    hygr:使潮霉素β失活。

    ③  看多克隆位點(MCS):它具有多個限制內切酶的單一切點(質粒上只能有該內切酶的*酶切序列,不然就一刀好幾段了),便于咱們要研究的基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入,會導致某種標志基因的失活,而便于篩選,常見的是β-半乳糖苷酶的藍白斑篩選系統。

    ④再看外源DNA插入片段大?。嘿|粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA的片段。一般來說,外源DNA的片段越長,越難插入,越不穩定,轉化效率越低。

    ⑤ 是否含有表達系統元件,即啟動子(promoter)-核糖體結合位點(RBS)-轉錄終止信號(AATAAA同時是poly A)。這是用來區別克隆載體與表達載體??寺≥d體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體,還是要以實驗目的為準繩。

    ⑥看報告基因:主要是為了能迅速檢查功能基因是否表達的陽性判斷,表達成功的蛋白在小鼠體內分布位置。
     
    ⑦看質粒圖譜上的箭頭:它代表DNA兩條鏈(正義鏈和反義鏈),即質粒是環狀雙鏈DNA,它的啟動子等在其中一條鏈上,而它的抗性基因在另一條鏈上。
    目的基因片段進行連接。

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